To rekombinowane białko było również słabo rozpuszczalne w PBS. Hamowanie p38 zapobiega indukowanej przez toksynę A (3 naciekowi neutrofili i zapaleniu jelit u myszy. Aktywacja kinazy p38 MAP toksyny wywołanej przez toksynę C. difficile jest wymagana do wytwarzania IL-8, martwicy i IL-1 (3. uwalnianie przez monocyty in vitro. Aby ocenić znaczenie patofizjologiczne tego modelu in vitro, badaliśmy, czy inhibitor p38 SB203580 może zapobiegać zapaleniu jelit indukowanemu przez toksynę Ap u myszy. SB203580 (lub jego nieaktywny analog SB202474) wstrzyknięto do światła pętli dookoła 3. 4 cm (100. G / pętlę) 30 minut przed podaniem toksyny A. SB203580 zapobiegał wydzielaniu płynu o 74% (P <0,001; n = 10), podczas gdy nieaktywny analog SB202474 nie wywierał istotnego wpływu (P = 0,4, Figura 7a). Jak oceniono za pomocą histologii, stosując ocenę nacieku neutrofilów, obrzęku i destrukcji kosmków, SB203580 zmniejszył ciężkość zapalenia jelit o 78% (P = 0,005). Podawanie SB202474 nie zmniejszyło znacząco objawów zapalenia jelit (p = 0,5, fig. 7, b i c). Doustne podawanie SB203580 (20 mg / kg) 30 minut przed prowokacją toksyną nie zapobiegło zapaleniu jelit (dane nie pokazane). Wyniki te wskazują, że p38 odgrywa kluczową rolę w rekrutacji neutrofili i zapaleniu jelit wywołanym przez toksynę A C. difficile in vivo. Figura 7 Hamowanie kinazy MAP 38 p38 zapobiega indukowanemu przez toksynę A zapaleniu jelit w mysim jelicie krętym. Inhibitor p38 SB203580 lub SB202474, związek kontrolny nieaktywny względem aktywności kinazy p38 (100 .g / pętlę), wstrzyknięto do światła pętli jelita krętego, jak opisano w Metodach. Po 30 minutach podano toksynę A (10 (ig) i zwierzęta uśmiercono 4 godziny później. Wykreślono pętle i oceniono wydzielanie płynu przez pomiar stosunku ciężar / długość (mg / cm). Stopień nasilenia zapalenia jelit mierzono histologicznie, stosując oceny w celu określenia ilościowego nacieku neutrofili, zatory i niszczenia kosmków. (a, b) SB203580 zahamowało wydzielanie płynu toksyny Ap przez 74% (a) (P <0,001) i zmniejszenie nasilenia zapalenia jelit o 78% (P = 0,005) (b), podczas gdy nieaktywny analog SB202474 nie wywierał znaczącego wpływu ( średnie i SE są pokazane, 9. 10 pętli na grupę). (c. f) Histologiczne cechy indukowanego przez toksynę A. zapalenia jelit i ich hamowanie przez SB203580. (c) Kontroluj ileum. (d) Toksyna A jako jedyna powoduje zniszczenie architektury kosmków, infiltrację neutrofili, obrzęk i owrzodzenie. (e) wstępne traktowanie SB203580 zachowało integralność kosmków, zapobiegało infiltracji i owrzodzeniu neutrofilów oraz częściowo zahamowało obrzęk. (f) obróbka wstępna SB202474 nie była ochronna. Dyskusja Badanie to pokazuje, że w ludzkich komórkach monocytowych kinazy ERK i p38 MAP są aktywowane przez toksynę A C. difficile i są wymagane zarówno do ekspresji genów IL-8, jak i do martwicy komórek. Wyniki te są zgodne z ostatnimi badaniami wykazującymi, że ERK i p38 zwiększają wytwarzanie IL-8 w odpowiedzi na prozapalne cytokiny lub LPS (29, 30). Zgodnie z naszą wiedzą, jest to pierwszy raport, że te kinazy MAP pośredniczą w szlaku martwicy komórki. Niedawno wykazaliśmy, że nekroza monocytów jest regulowanym szlakiem śmierci komórkowej, w której pośredniczą proteazy kaspazy i niedobór potasu (19). Badanie to wskazuje, że kinazy ERK i p38 MAP są szczególnie zaangażowane w martwicę wywołaną przez toksynę A. Blokowanie szlaków ERK i p38 nie miało wpływu na martwicę monocytów wywołaną przez niglicerynę lub p-toksynę gronkowcową. Ścieżki ERK, p38 i JNK zostały niedawno zaangażowane w kontrolę przeżycia komórek w odpowiedzi na różne stresy w sposób specyficzny dla komórki i bodźca. Apoptoza może być wywołana przez hamowanie ERK (31, 32) lub zapobiegać przez hamowanie ERK (33, 34). Podobnie, blokowanie p38 powoduje apoptozę komórek Jurkat limfocytów T (35), ale zapobiega spontanicznej apoptozie w neutrofilach (36). Mechanizmy, w których kinazy ERK i p38 MAP pośredniczą w martwicy komórek w monocytach eksponowanych na toksynę A, są nadal niejasne. Jedną z możliwości jest to, że martwica monocytów indukowana przez toksynę A może być mediowana przez cytotoksyczne utleniacze. Aktywowane monocyty mogą wytwarzać wysokie poziomy reaktywnych form tlenu, a ich wytwarzanie jest częściowo kontrolowane przez ERK i p38 przez aktywację fosfolipazą A2 (37). W monocytowych komórkach eksponowanych na toksynę A aktywacja kinazy MAP następuje bardzo szybko (w ciągu do 2 minut), około 15 minut przed ujawnieniem glukozylacji białka Rho. Ten przebieg czasowy potwierdza hipotezę, że oddziaływanie toksyny z receptorem na powierzchni komórki może wyzwalać aktywację kinazy MAP. Glukozylację Rho wykrywa się później, ponieważ to zdarzenie jest następstwem internalizacji toksyny i przeniesienia do cytoplazmy. Stąd te odkrycia sugerują, że początkowa aktywacja kinazy MAP może być niezależna od glukozylacji Rho i podnosić hipotezę, że wytwarzanie IL-8 wywołanej przez toksynę A może być niezależne od jego aktywności enzymatycznej. [więcej w: bakteryjne zapalenie pochwy leki, witaminy dla nastolatków, rezonans magnetyczny przeciwwskazania ] [hasła pokrewne: program promocji zdrowia, choroba dwubiegunowa przyczyny, tomografia komputerowa cennik ]
