Komórki THP-1 stymulowano toksyną A (100 nM) przez różne okresy czasu. Aktywności ERK 1/2 (a), p38 (b) i JNK1 (c) zmierzono metodą immunoblottingu z użyciem przeciwciał fosfospecyficznych (górne panele). Aktywności enzymatyczne ERK2, p38 i JNK1 mierzono testami kinazy in vitro po immunoprecypitacji (dolne panele). Mielinowe białko podstawowe (MBP) zastosowano jako substrat dla ERK2 i p38, a GST-c-Jun1-79 zastosowano dla JNK1. Wywołana toksyną A (12 minut) aktywacja ERK1 / 2, p38 i JNK1. Po 1-godzinnej inkubacji aktywność p38 zwiększono 6,7-krotnie, jak określono metodą densytometrii, podczas gdy aktywności ERK i JNK powróciły do poziomów kontrolnych. (d) Aktywności kinazy ERK2 i p38 mierzono w komórkach THP-1 albo 2 minuty (dla ERK2), albo 30 minut (dla p38) po stymulacji toksyną A (100 nM). Wstępne traktowanie inhibitorem MEK1 / 2 PD98059 (20 (M) przez 30 minut zapobiegło aktywacji ERK2, podczas gdy wstępne traktowanie inhibitorem p38 SB203580 (10. M) blokowało aktywność kinazy p38. Ścieżki ERK i p38 są wymagane do uwalniania IL-8 wywołanego toksyną A .. Aby ocenić znaczenie biologiczne aktywacji kinazy MAP w wywołanym toksyną A (3 wywołanym uwalnianiu IL-8, zbadano wpływ PD98059, który hamuje MEK1 / 2, kinazę MAP fosforylującą ERK1 / 2. W doświadczeniach kontrolnych PD98059 zapobiegał indukowanej przez toksynę A (3 aktywacji ERK2 w komórkach THP-1, jak określono za pomocą testu kinazy in vitro, ale nie wywierał znaczącego wpływu na aktywność kinazy p38 (Figura 1d). Odwrotnie, inhibitor p38 SB203580 blokował indukowaną przez toksynę Ap aktywność kinazy p38 bez zapobiegania aktywacji ERK2 (Figura 1d). Jak pokazano na Figurze 2a, wstępne traktowanie komórek THP-1 PD98059 przez 30 minut hamowało uwalnianie IL-8 indukowane przez toksynę A (100 nM przez 4 godziny). Efekt był zależny od dawki (IC50, 2. M), a 10. M PD98059 hamował uwalnianie IL-8 indukowane przez toksynę A. O 70%. IC50 dla stymulowanej LPS produkcji IL-8 wynosiło 10 .M. W prawidłowych monocytach PD98059 (20 | jM) hamowało toksynę A (2 nM), a LPS (1 | ag / ml) indukowało wytwarzanie IL-8 odpowiednio o 82 i 52% (Figura 2b). Figura 2 Ścieżka ERK jest wymagana do indukowanego przez toksynę A (3 IL-8. (a) Komórki THP-1 (106 / ml) wstępnie inkubowano z różnymi stężeniami inhibitora MEK PD98059 przez 30 minut. Następnie komórki stymulowano toksyną A C. difficile (100 nM) lub LPS (1 ug / ml) przez 4 godziny. PD98059 częściowo hamował uwalnianie IL-8 indukowane przez toksynę A i LPS (IC50, 2 i 10. M, odpowiednio). Oznaczać . SE pokazano (n = 3). (b) Monocyty krwi obwodowej inkubowano w obecności PD98059 przez 30 minut, a następnie stymulowano przez 4 godziny toksyną A C. difficile (2 nM) lub LPS (1 .g / ml). PD98059 znacząco zmniejszał wytwarzanie IL-8 przez oba bodźce. Wyniki wyrażono jako średnie i SE (n = 3, AP <0,001, BP <0,05). Zbadaliśmy również wpływ pirydynyloimidazolu SB203580, który specyficznie hamuje p38 (22) i p38. (26), ale nie p38. (27) lub p38. (28). Wstępne traktowanie komórek przez 30 minut zapobiegło indukowanemu przez toksynę A (3 uwalnianiu IL-8 w sposób zależny od dawki (IC50, 30 nM) (Figura 3a). SB203580 (10 (M) powodowało 95% hamowanie wytwarzania IL-8 w odpowiedzi na toksynę A w komórkach THP-1 (Figura 3a) i 98% hamowanie w monocytach (Figura 3b). Co ciekawe, SB203580, po wstępnej inkubacji przez 30 minut, nie hamował wytwarzania IL-8 stymulowanego przez LPS (1 .g / ml). Jednakże, po wstępnej inkubacji przez dłuższy czas (1 lub 2 godziny), SB203580 hamował wytwarzanie IL-8 z udziałem LPS o ponad 86%, podczas gdy jego siła działania na działanie toksyny A nie była zwiększona (Figura 3c). Podstawa tych różnic nie została zbadana, ale może odzwierciedlać wymaganie wyższych poziomów wewnątrzjądrowych inhibitora, aby zablokować działanie LPS. SB202474, analog SB203580, który nie hamuje aktywności kinazy p38, nie zapobiegał uwalnianiu IL-8 indukowanemu przez każdy z bodźców (Figura 3). Dane te wskazują, że szlaki sygnałowe ERK i p38 regulują uwalnianie IL-8 indukowane przez toksynę C. difficile w monocytach. Figura 3 Inhibitor p38 SB203580 zapobiega syntezie IL-8 indukowanej przez toksynę C. difficile A. (a) Komórki THP-1 (106 / ml) preinkubowano z różnymi stężeniami inhibitora p38 SB203580 przez 30 minut. Następnie komórki stymulowano przez 4 godziny toksyną A C. difficile (100 nM) lub LPS (1 ug / ml). SB203580 blokował uwalnianie IL-8 indukowane przez toksynę A (IC50, 20 nM), ale nie zapobiegał uwalnianiu IL-8 za pośrednictwem LPS. (b) Monocyty krwi obwodowej preinkubowano z SB203580 (10 .M) przez 30 minut, a następnie stymulowano przez 4 godziny toksyną A C. difficile (2 nM) lub LPS (1 .g / ml). SB203580 znosiło uwalnianie IL-8 indukowane przez toksynę A (3, ale nie wpływało na indukowane LPS wytwarzanie IL-8 [przypisy: witaminy dla nastolatków, leclerc szczecin godziny otwarcia, bakteryjne zapalenie pochwy leki ] [podobne: szczepienie dur brzuszny, witaminy dla nastolatków, makabi ]
