Komórki były również traktowane TGF-y, antymitogenem, który działa głównie poprzez hamowanie fosforylacji kieszonkowych białek (27). Jak pokazano na Figurze 3a, E7 spowodował wzrost aktywności promotora cykliny A ponad czterokrotnie w komórkach traktowanych surowicą, APOA-I, C-końcową domeną APOE lub TGF-a, przypuszczalnie z powodu pełnej sekwestracji kieszeni białka i uwolnienia E2F. Chociaż E7 stymulował także aktywność promotora cykliny A w komórkach traktowanych APOE lub jego N-końcową domeną (APOE22), efekt był niewielki w porównaniu z obserwowanym w przypadku innych terapii. Ponieważ APOE i jego N-końcowa domena hamują promotor cykliny A pomimo sekwestracji białka kieszeni przez E7, albo (a) hamują promotor przez niezależny szlak kieszonkowego białka lub (b) mają niezależne od siebie białko kieszonkowe, a także zależne od niego efekty na promotorze cykliny A. Podobne wyniki otrzymano stosując APOE lub domenę N-końcową z linią A10 SMC (nie pokazano). Figura 3 Wpływ zależnych od białka PEGA APOE na transkrypcję genu cykliny A. (a) Aktywność promotora cykliny A w wczesnych pasażach aortalnych SMC określono sposobem opisanym w metodach. Aktywność promotora wykreślono jako krotność stymulacji względem komórek traktowanych FBS pod nieobecność E7. Wyniki pokazują średnią. SEM, n = 3, * P <0,001 w porównaniu z transfekowanymi komórkami stymulowanymi samym FBS. (b) Wczesne przejście aorty SMC przejściowo kotransfekowano plazmidem E2F-CAT i wektorem ekspresyjnym E7 (+ E7) lub pustym wektorem (AE7). Po głodzeniu w surowicy, spoczynkowe transfektanty bezpośrednio stymulowano 10% FBS przez 18 godzin pod nieobecność (kontrola) lub obecność 2. M APOE. Poziomy enzymu CAT zmierzono zgodnie z opisem w Metodach. Wyniki pokazują średnią. SEM, n = 2, * P <0,001 w porównaniu z transfekowanymi komórkami stymulowanymi samym FBS (kontrola; EE7). (c) Spoczynkowe mysie aorty SM są stymulowane w surowicy pod nieobecność lub bez obecności 2. M APOE przez 18 godzin. Zebrane komórki poddano lizie i analizowano przez immunoblotting dla pRb, p107 i cdk4. Podfosforylowane i hiperfosforylowane formy pRb i p107 są pokazane odpowiednio za pomocą dolnej i górnej strzałki. (d) Spoczynkowe SMC A10 stymulowano w surowicy pod nieobecność lub bez obecności 2. M APOE przez 15 godzin, zbierano, poddawano lizie i analizowano przez immunoblotting dla cykliny E. Lizaty komórkowe inkubowano z anti-cykliną E i stosowano immunoprecypitaty. do oceny aktywności kinazy in vitro lub analizowano przez immunoblotting dla związanego cdk2. Przeprowadziliśmy kotransfekcję mysich aortalnych SMC z minimalnym konstruktem promotor-reporter E2F-CAT i wektorem ekspresyjnym E7, aby określić, czy działanie APOE na aktywność promotora cykliny A obejmuje szlak zależny od E2F / białka kieszeni. Transfekowane komórki były głodzone w surowicy, a następnie stymulowane surowicą przez 18 godzin w obecności lub nieobecności APOE. APOE hamował aktywność E2F (Figura 3b, E7), a hamowanie aktywności E2F zostało całkowicie przezwyciężone przez ekspresję E7 (Figura 3b; + E7). Zatem, APOE może ogólnie hamować geny zależne od E2F. Ponadto, APOE blokował hiperfosforylację pRb i p107 zarówno w mysich aortalnych SMC (Figura 3c), jak i w linii SMC A10 (nie pokazano). Efekt ten był związany z hamowaniem aktywności cykliny E-cdk2 (rysunek 3d), ale dokładny mechanizm nie jest jeszcze jasny, ponieważ APOE nie zmienia poziomów cykliny D1, cykliny E, cdk2, cdk4, p21cip1 lub p27kip1 (rysunek 3, c. D, a dane nie pokazane). Co ciekawe, jest to ten sam fenotyp, który widzieliśmy podczas badania antyimitogennego działania prostacykliny (patrz 13 i zobacz poniżej). APOE INHIBITS CRE-DEPENDENT CYCLIN A GENE EXPRESSION. Ponieważ wyniki opisane na fig. 3, bd, wskazują, że APOE powinien hamować zależną od E2F / zależną od białka kieszeń transkrypcję, brak silnej aktywności promotora cykliny A w komórkach traktowanych APOE eksprymujących E7 (figura 3a) był prawdopodobnie spowodowany dodatkowymi, niezależne działanie białka APOE na promotor cykliny A. Rzeczywiście, EMSA wykazały, że chociaż APOE nie zmienia obłożenia miejsca CCAAT promotora cykliny A, to znacznie zmniejszył obłożenie jego miejsca CRE (Figura 4a). Natomiast APOA-I nie wpłynęło na żadne miejsce (rysunek 4a). Supershift EMSA wykazały, że CREB i mała ilość ATF-1 były związane z CRE, ale inne potencjalne białka wiążące CRE, takie jak ATF-2, c-fos i c-jun, nie zostały wykryte (Figura 4b). Zauważ, że rodzina Ab pełnej paneli przerobiła kompleks CRE (Rycina 4b) i że CREM (który zawiera rodzinę CREB wraz z CREB i ATF-1) nie jest wyrażany w aortalnych SMC (28). Wyniki te wskazują, że CREB, ATF-1 i ich fosforylowane odpowiedniki mogą w pełni odpowiadać aktywności wiązania CRE lizatu SMC. [podobne: dieta paleo jadłospis na tydzień, stargard szczeciński szpital, football trening ] [hasła pokrewne: etnoliga, football trening, program promocji zdrowia ]
