Wejście fazy S komórek transfekowanych (eGFP-dodatnich) określono przez inkorporację BrdU. W przypadku testów zmian ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testów super-przesunięcia, mysie aorty SMC doprowadzono do 80-90% konfluencji w naczyniach o średnicy 150 mm, pozbawiono surowicy i bezpośrednio stymulowano przez 18 godzin 10% FBS pod nieobecność lub obecność APOA-I lub APOE. Lizaty jądrowe przygotowano i inkubowano ze znakowanymi oligonukleotydami odpowiadającymi miejscu CRE i CCAAT, jak opisano (13). Testy kinazy in vitro. SMC A10 hodowano do 80-90% konfluencji w naczyniach o średnicy 150 mm, pozbawiono surowicy i stymulowano 10% FCS w nieobecności lub obecności 2. M APOE, jak opisano powyżej. Komórki przemyto raz PBS i poddano lizie, jak opisano (22). Ekstrakty z zebranych komórek inkubowano z anty-cykliną E (4 .g / 300 .g lizatu) lub frakcją siarczanu amonu anty-cykliny A (40 .g / 100 .g lizatu). Zebrane immunoprecypitaty podzielono na dwie równe frakcje i użyto do pomiaru aktywności kinazy w kierunku histonu H1 lub tworzenia kompleksu z cdk2 jak opisano (13). 6-keto-prostaglandyna F1. enzymatyczny test immunologiczny. Spoczynkowe WT i SMC o zerowym IP zostały doprowadzone do 80-90% konfluencji w 100-mm naczyniach, pozbawione surowicy i bezpośrednio stymulowane 10% FBS pod nieobecność lub obecność 2. M APOE. Kondycjonowane pożywki (100 ul) zebrano z komórek po 24 lub 48 godzinach. Kondycjonowane pożywki badano następnie na obecność 6-keto-prostaglandyny F1. (6-keto-PGF1a) przy użyciu zestawu do testu immunoenzymatycznego (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, USA). Analiza mRNA Cox-2 i białka. Wpływ lipoprotein i apo. Na mRNA Cox-2 i białko określono odpowiednio przez PCR i immunoblotting. Mysie aorty SMC wzrastały do 80-90% konfluencji w naczyniach o średnicy 150 mm, pozbawiono surowicy przez 48 godzin w określonej pożywce (patrz powyżej) i bezpośrednio stymulowano 10% FBS przez 18 godzin. Całkowity RNA izolowano z komórek poddanych lizie w odczynniku Trizol (Invitrogen), a 2 .g z każdej próbki zastosowano do syntezy cDNA z zastosowaniem układu przedwzmacniania Superscript II (Invitrogen). Próbkę (10%) cDNA poddano następnie 35 cyklom PCR, stosując polimerazę Taq DNA, topienie w 94 ° C, hybrydyzację w 55 ° C (1 minuta) i wydłużanie w 72 ° C (1 minuta). Startery były specyficzne dla mysich Cox-1, Cox-2 i GAPDH (23) lub ludzkich Cox-1 (sens: 5 (3-CTGGTGGATGCCTTCTCTCGCC-3 (3 antysensowny: 5 (3-GTCTTGGTGTTGAGGCAGACCAG-3 (3), Cox-2 ( sens: 5. -CAGCAAATCCTTGCTGTTCC-3 (3, antysensowny: 5 (3 -GAGAAGGCTTCCCAGCTTT-3.). Amplifikowane produkty analizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i barwienia bromkiem etydyny, a zmiany w ilości oznaczano ilościowo przy użyciu oprogramowania NIH Image 1.63. Lizaty aortalnych SMC także analizowano przez immunoblotting dla białka Cox-2, jak opisano powyżej. Stymulacja in vivo mRNA Cox-2 przez ekspresję APOE. W celu ekspresji APOE in vivo zastosowano rekombinowany adenowirus drugiej generacji, kodujący cDNA ludzkiego APOE3 (AdAPOE3), jak opisano wcześniej (24). W sumie 12, 6- do 8-tygodniowych samic myszy WT C57BL / 6 (cztery na grupę) wstrzyknięto do żyły ogonowej 1011 cząsteczek AdAPOE3, wirusa AdapOA-I drugiej generacji lub kontrolnego wirus (Adnull). Myszy uśmiercono 3 dni po wstrzyknięciu i perfundowano z lodowatym PBS, i zebrano całą aortę. Nasze poprzednie badania wykazały, że białka ulegające ekspresji adenowirusa gromadzą się w ścianie naczynia (25). Rozcięto części aorty i pobrano starannie tkankę obcą od strony przydanki. Tkankę następnie natychmiast zanurzono w RNAlater (QIAGEN Inc., Valencia, California, USA) i ręcznie homogenizowano. Homogenat potraktowano proteinazą K (55 ° C, 10 minut, QIAGEN Inc.) i sklarowano przez odwirowanie (30 minut, 10 000 g, 20. 25 ° C). Supernatant zmieszano z 0,5 objętościami etanolu i oczyszczono na kolumnie RNeasy mini (QIAGEN Inc.). Całkowity RNA (2 ug) poddano odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem układu do przedwzmacniania Superscript II. Próbkę (40%) cDNA analizowano metodą PCR, jak opisano powyżej. Procedury dotyczące myszy zostały zatwierdzone przez University of Pennsylvania i Wistar Institutional Animal Care and Use Committees. Wyniki HDL i APOE hamują wejście fazy S do aortalnych SMC. Początkowo porównaliśmy wpływ HDL i LDL na wchodzenie w fazę S wczesnych pasaży aorty SMC. SMC aorty były głodzone w surowicy i stymulowane surowicą w podkonfliktach w obecności BrdU; komórki te wykazywały zależny od czasu wzrost do fazy S podczas 48 godzin stymulacji surowicy. LDL miał znikomy wpływ na kinetykę wejścia fazy S, ale HDL hamował wejście fazy S o więcej niż 50% (Figura 1a). Co więcej, antymitogenny efekt HDL został utracony, gdy APOE został zubożony w lipoproteinę (rysunek 1a)
[patrz też: karpacz informacja turystyczna, stargard szczeciński szpital, szpital lublin jaczewskiego ]
[przypisy: szpital lublin jaczewskiego, dieta paleo jadłospis na tydzień, szczepienie dur brzuszny ]
