Wpływ HDL był zależny od dawki, przy IC50 około 20 .g / ml. Oczyszczone rekombinowane APOE również zahamowały wejście fazy S w sposób zależny od dawki, podczas gdy oczyszczona rekombinowana APOA-I nie miała żadnego działania (Figura 1c). Wytworzyliśmy N-końcowe 22-kDa i 10-kDa C-końcowe domeny APOE jako rekombinowane białka i odkryliśmy, że antymitogenna aktywność APOE była w dużej mierze zawarta w N-końcowej domenie wiążącej receptor (patrz Figura 1c, porównaj APOE10 z APOE22. ). Figura 1HDL i APOE hamują wejście fazy S w aorty w SMC. (a) Spoczynkowe tryskanie aorty SMC poddawano trypsynizacji i replikowano 10% FBS w wybranych czasach w nieobecności (kontrola) lub obecności 50 .g / ml HDL zubożonego w LDL, HDL lub HDL. (b) Komórki spoczynkowe stymulowano 10% FBS przez 48 godzin w obecności rosnących stężeń HDL z niedoborem LDL, HDL lub APOE. (c) Spoczynkowe tryskanie aorty SMC poddano trypsynizacji, dodano do szalek 35 mm zawierających szkiełka nakrywkowe i stymulowano 10% FBS przez 48 godzin w obecności wzrastających stężeń APOA-I, APOE, APOE22 lub APOE10. Wbudowanie BrdU w jądra oznaczono za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wyniki pokazują średnią. SEM, n = 3, * P <0,01 w porównaniu z komórkami traktowanymi samym 10% FBS. APOE hamuje ekspresję genu cykliny A poprzez niezależne i niezależne szlaki białka kieszeni. Ponieważ indukcja cykliny A reguluje wejście komórek w fazę S, wpływ APOE na ekspresję cykliny A i aktywność promotora badano we wczesnych pasażach aorty SMC. Porównaliśmy działanie APOE i APOA-I na aorty SMC przejściowo transfekowane wektorem ekspresyjnym reportera lucyferazy cykliny A. Wstępne badania wykazały, że promotor cykliny A był optymalnie indukowany około 18 godzin po stymulacji surowicy SMC w stanie spoczynku (dane nie przedstawione). APOA-1 (2 .m) minimalnie (<10%) wpływał na aktywację promotora cykliny A, podczas gdy APOE wykazywały zależne od dawki hamowanie, które osiągnęło więcej niż 70% (Figura 2a). Cyklina A była wyrażana w 85% jąder po tym, że SMC z aorty stymulowano surowicą lub surowicą za pomocą APOA-I (Figura 2b). Cyklina A była jednak eksprymowana tylko w 35% jąder w komórkach traktowanych surowicą i APOE (Figura 2b). Analiza przebiegu czasowego wykazała, że ekspresja cykliny A była indukowana w aortalnych SMC przez 24 godziny stymulacji surowicy i że indukcja była hamowana przez APOE (Figura 2c). Cyklina D1 i cyklina E nie ulegały wpływowi APOE (rysunek 2c). Ponadto, ektopowa ekspresja cykliny A w mysich SMC uratowała wejście fazy S w obecności APOE (Figura 2d). APOE hamował również wejście fazy S (nie pokazane), ekspresję cykliny A i aktywność kinazy związanej z cykliną Ap w linii SMC szczura A10 (Figura 2e). Figura 2 Hamowanie ekspresji genu cykliny A przez APOE. (a) Aktywność promotora cykliny A w wczesnych pasażach aortalnych SMC określono sposobem opisanym w metodach. Wyniki pokazują średnią. SEM, n = 3, * P <0,001 w porównaniu z komórkami stymulowanymi 10% FBS. C, kontrola. (b) Spoczynkowe SMC inkubowano przez 48 godzin z 10% FBS w nieobecności lub obecności 2. M APOA-I lub APOE przed analizą ekspresji cykliny A za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Barwienie DAPI pokazuje jądra komórkowe. (c) Spoczynkowe mysie aorty SMC potraktowane 10% FBS w nieobecności lub obecności 2. M APOE zebrano, poddano lizie i analizowano przez immunoblotting stosując Ab. s do cykliny D1, cykliny E, cykliny A i cdk4 (kontrola obciążenia ). (d) Aortyczne SMC przejściowo kotransfekowano wektorem ekspresyjnym eGFP i albo wektorem ekspresyjnym kontrolnym (wektor) albo cykliną A. Wpływ ekspresji cykliny A na wejście fazy S określono w nieobecności lub obecności 2. M APOE lub 2. M APOA-I, jak opisano w Methods. Wyniki pokazują średnią. SEM, n = 2, * P <0,001 w porównaniu z komórkami stymulowanymi 10% FBS (wektor). (e) A10 SMC traktowano jak w c, zebrano po 20 godzinach, poddano lizie i analizowano przez immunoblotting dla cykliny A i aktyny (kontrola obciążenia). Lizaty komórkowe inkubowano z anty-cykliną A, a immunoprecypitaty zastosowano do oceny aktywności kinazy in vitro lub analizowano przez immunoblotting dla związanego cdk2. Przeprowadziliśmy kotransfekcję mysich aortalnych SMC z konstruktem reportera cykliny A-lucyferazą i wektorem ekspresyjnym E7 wirusa brodawczaka ludzkiego 18, aby zbadać wpływ APOE na aktywność promotora cykliny A zależnego od białka kieszeniowego. E7 sekwestruje białka kieszeni (26) i naśladuje fosforylację za pośrednictwem cdk, powodując transkrypcję genów, takich jak cyklina A. Transfekowane komórki były głodzone w surowicy, a następnie stymulowane surowicą przez 18 godzin w obecności APOA-I, APOE lub izolowanego Domeny APOE22 (N-terminal) i APOE10 (C-końcowe) [podobne: football trening, tomografia komputerowa cennik, szczepienie dur brzuszny ] [przypisy: witaminy dla nastolatków, makabi, makabi warszawa ]
