Martwe komórki zidentyfikowano przy użyciu utrwalanego zestawu Aqua Dead Cell Staining Kit (Invitrogen). Rekombinowany mysi M-CSF pochodził od Peprotech. Siarczan dekstranu sodu (masa cząsteczkowa, 40. 50 kDa) pochodził z firmy USB Corp. Isolation of LP cells. Izolację komórek LP przeprowadzono jak opisano wcześniej z modyfikacjami (15). W skrócie, jelita cienkie zostały usunięte i starannie oczyszczone ze swojej krezki, a łatki Peyera zostały wycięte. Jelito cienkie i grube otworzyło się podłużnie, przemyto zawartość kału, pocięto na kawałki o długości 0,5 cm i poddano dwu kolejnej 20-minutowej inkubacji w HBSS z 5% FCS i 2 mM EDTA w 37 ° C z mieszaniem w celu usunięcia komórek nabłonka. . Po każdym etapie inkubacji odrzucano pożywki zawierające komórki nabłonka i szczątki. Pozostałą tkankę mielono i inkubowano przez 20 minut w HBSS z 5% FCS, mg / ml kolagenazy IV (Sigma-Aldrich) i 40 U / ml DNazy I (Roche) w 37 ° C w trakcie mieszania. Zawiesiny komórkowe zebrano i przepuszczono przez filtr o średnicy 100 .m i osadzono przez odwirowanie przy 300 g. Cytometrii przepływowej. Izolowane komórki LP ponownie zawieszono w PBS zawierającym 5% FBS. Żywe komórki zidentyfikowano przy użyciu zestawu do zabarwienia komórek Martwych Celi Aqua zgodnie z instrukcjami producenta, a receptory Fc zablokowano przeciwciałem anty-FcyRIII / II (2,4G2) przez 15 minut w temperaturze 4 ° C. Po inkubacji komórki barwiono w temperaturze 4 ° C przez 30 minut znakowanymi przeciwciałami. Próbki następnie przemyto 2 razy w PBS zawierającym 5% FBS i natychmiast zanalizowano, lub barwienie wewnątrzkomórkowe przeprowadzono stosując zestaw do wiązania / permeabilizacji FoxP3 (eBioscience) lub zestaw Cytofix / Cytoperm z GolgiPlug (BD). Analizę cytometrii przepływowej przeprowadzono na LSR II (BD). Real-time PCR. Całkowity RNA wyizolowano z oczyszczonych makrofagów LP i DC przy użyciu zestawu QIAGEN RNeasy Mini Kit, zgodnie z protokołem producenta, z trawieniem DNazy na kolumnie przy użyciu zestawu DNazy wolnego od RNazy. cDNA wytworzono stosując system Superscript do syntezy pierwszej nici do RT-PCR i losowe startery heksamerowe (Invitrogen), zgodnie z protokołem producenta. cDNA zastosowano jako matrycę do qRT-PCR z użyciem SYBR Green Master Mix (Bio-Rad) i starterów dla Cx3cr1 (F, AGGACACAGCCAGACAAG; R, TCAGGGGAGAAGCAAG) i Gapdh (F, TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC; R, AAGATGGTGATGGGCTTCCCG). PCR i analizę przeprowadzono przy użyciu MyiQ iCycler (Bio-Rad), a ekspresję genu obliczono względem Gapdh. Indukowane przez DSS zapalenie jelita grubego. Myszom dostarczono 3% (wag./obj.) DSS rozpuszczonego w wodzie pitnej przez 5 dni. Codzienna ocena kliniczna zwierząt leczonych DSS obejmowała pomiar zweryfikowanego klinicznego DAI w zakresie od 0 do 4 (41), który obliczono przy użyciu następujących parametrów: konsystencja stolca, obecność lub brak krwi w kale (Hemoccult, Beckman Coulter) i waga utrata. Myszy zabito w dniu 5, a okrężnice oceniano pod kątem histologii. Blokowanie efektu cytokiny in vivo. U myszy z niedoborem CX3CR1 (Cx3cr1gfp / gfp lub Cx3crlp / a) lub Cx3cr1 + / + zastosowano DSS, jak opisano powyżej. Myszom wstrzyknięto 200. G neutralizujących przeciwciał kontrolnych IL-17A lub izotypowych w dniach 0, 2 i 4. Zapalenie okrężnicy oceniano jak opisano powyżej. Przybieranie szpiku kostnego. Całkowite komórki szpiku kostnego myszy Cx3cr1gfp / gfp lub Cx3cr1 + / + hodowano w obecności 10 ng / ml M-CSF. Pożywkę wymieniano co 2 dni, a w dniu 7 zbierano adherentne makrofagi. BMDM (1 x 106) przeniesiono adoptywnie (wstrzyknięcie do żyły ogonowej) myszom Cx3cr1 + / + lub Cx3cr1gfp / gfp w dniach 1-1 i +1 leczenia DSS. Zapalenie okrężnicy oceniano w sposób opisany powyżej. Kultura bakteryjna. Całkowitą zawiesinę komórek mLN hodowano w warunkach tlenowych na płytkach z agarem LB z krwią przez 24 godziny w 37 ° C. Całkowity DNA wyizolowano bezpośrednio z poszczególnych kolonii i zsekwencjonowano pod kątem genu 16S rDNA, stosując następujące startery: F, AGAGTTTGATCACTGGCTCAG; R, CTGCTGCCTCCCGTAGGAGT. Wyrównanie homologii przeprowadzono przy użyciu oprogramowania NCBI BLAST. Statystyka. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą oprogramowania Prism (GraphPad Software), stosując niesparowany dwustronny test Studenta. Słupki błędów przedstawiają SD lub SEM, jak wskazano. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. Materiały uzupełniające Zobacz dodatkowe dane Podziękowania Podziękowania dla Aaron Rae (Departament Pediatrii i Opieki Zdrowotnej Atlanta Flow Core firmy Emory University) za sortowanie komórek. Praca ta była wspierana przez granty NIH (AA01787001, AI083554 do TL Denning, DK055679 do A. Nusrat, DK064730 do IR Williamsa, DK72654 i DK79392 do CA Parkos), Nagrodę za Rozwój Zawodowy z Fundacji Lochów Crohna i Colitis w Ameryce oraz grant Emory Egleston Children s Research Center dla TL Denning. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2011; 121 (12): 4787. 4795. doi: 10.1172 / JCI59150.
[patrz też: tomografia komputerowa cennik, program promocji zdrowia, makabi warszawa ]
[hasła pokrewne: szczepienie dur brzuszny, witaminy dla nastolatków, makabi ]
