Komórki TUNEL-dodatnie zmniejszono z 11,4%. 1,1% do 3,3%. 0,8% według H-89 (n = 4, P <0,01), zgodnie z wcześniejszymi sprawozdaniami (12). Jednak interpretacja eksperymentów z użyciem H-89 jest skomplikowana przez ostatnie odkrycie, że H-89 jest również silnym blokerem AR (24). W związku z tym zahamowaliśmy tę drogę stosując wysoce swoisty, przepuszczalny dla błony inhibitor peptydu PKA, PKI (25) i nieaktywny analog cAMP, Rp-cAMP (26). Wstępne traktowanie miocytów Rp-cAMP (100 .M) lub PKI (5 .M) całkowicie zniosło zależną od PKA fosforylację PLB (Figura 1b), kluczowe docelowe białko docelowe PKA, które reguluje aktywność pompy SR Ca2 + (27), w ten sposób potwierdzając skuteczność tych inhibitorów PKA w zniesieniu sygnalizacji cAMP / PKA. Zaskakująco, żaden inhibitor PKA w tych samych odpowiednich stężeniach nie wywierał istotnego wpływu na apoptozę, w której pośredniczy A (1AR (Figura 1, a i c) e, i Figura 5c). Niezdolność inhibitorów PKA do ochrony miocytów sercowych przed apoptozą indukowaną przez 1AR została potwierdzona w modelu. 2AR KO, w którym gęstość i funkcjonalność natywnych pA1AR pozostają niezmienione (19), a w myotach myszy WT poddanych ISO w obecność blokady. 2AR. Stymulacja natywnego aAR w dorosłych. 2AR KO lub WT miocytach sercowych za pomocą ISO podobnie zwiększonych komórek TUNEL-dodatnich, nawet w obecności PKI lub Rp-cAMP (Figura 2). Tak więc, chociaż uważa się, że szlak sygnałowy cAMP / PKA jest jedynym mechanizmem odpowiadającym na odpowiedzi a-1-adrenergiczne, transdukcja sygnału apoptotycznego AAR zasadniczo omija ten szlak. Rola G. lub sygnalizacja Gi. W celu zidentyfikowania mediatora molekularnego dla apoptotycznego efektu zależnego od PKA-1AR, testowaliśmy kilku kandydatów, w tym wolną G uwalniane z heterotrimerycznych białek Gs lub białek G innych niż Gs (np. białka Gi). Możliwy udział G lub sygnalizację Gi w apoptozie za pośrednictwem AARAR badano przez adenowirusowy transfer genu C-końcowej domeny kinazy. AR (. ARK-ct) w celu zahamowania G sygnalizacja (28) i wstępne traktowanie komórek za pomocą PTX w celu rozbicia sygnalizacji Gi (29). Ani ARK-ct ani PTX nie wpłynęły istotnie na. Apoptotyczne fragmentowanie DNA za pośrednictwem 1AR (Figura 3). Przeciwnie, obydwie interwencje skutecznie blokowały efekt antyapoptotyczny A2AR, w którym pośredniczą G (3 i Gi, w podobnych warunkach eksperymentalnych (5) i zapobiegały aktywacji PI3K za pośrednictwem G3 (30). Te wyniki wykluczają możliwość, że G lub sygnalizacja Gi odpowiada za apoptozę kardiomiocytów za pośrednictwem AARAR. Rysunek 3G lub sygnalizacja Gi nie bierze udziału w apoptozie kardiomiocytów indukowanej przez 1AR. Ani zahamowanie G sygnalizowanie przez adenowirusową ekspresję ARK-ct, ani zakłócanie sygnalizacji Gi przez wstępne traktowanie komórek PTX (1. g / ml przez 3 godziny) spowodowało zmienioną fragmentację DNA indukowaną przez ISO (1. M) oznaczoną testem ELISA śmierci komórek w. 1. 2 komórki DKO zainfekowane AdvarAAR. * P <0,01 vs. miocyty nieleczone ISO. n = 6. 7 niezależnych eksperymentów dla każdej grupy. Istotna rola wejścia Ca2 + i wewnątrzkomórkowego Ca2 + w sygnalizację apoptotyczną a1AR. Wykazano, że zmieniona sygnalizacja Ca2 + sprzyja apoptozie w różnych typach komórek (31). Następnie zbadaliśmy możliwość, że Ca2 +, zamiast cAMP, działa jako drugi przekaźnik, który przekazuje sygnał apoptotyczny AARAR w miocytach sercowych. W miocytach DKO zakażonych Adv-1ARAR, traktowanie ISO przez 3. 6 godzin (tuż przed manifestacją apoptozy indukowanej. 1AR) znacząco podwyższyło wewnątrzkomórkowe wolne Ca2 + mierzone z wrażliwą na Ca2 + sondą fluorescencyjną indo-1. Jak pokazano na Figurze 4a, przedłużona stymulacja a 1AR zwiększyła podstawowy cytozolowy Ca2 + z 122,8. 5,8 (n = 32 komórki z sześciu serc) do 308,7. 9,7 nM (n = 29 komórek z sześciu serc). Ta odpowiedź Ca2 + pozostawała w dużej mierze w stanie nienaruszonym w obecności PKI (5. M), ale została zniesiona przez nifedypinę (1. M), antagonistę kanału Ca2 + typu L, co wskazuje na wzrost wewnątrzkomórkowego Ca2 + za pośrednictwem prądów Ca2 + typu L (ICa) ) (Rysunek 4a). Ponadto, zmierzono wewnątrzcząsteczkowe przejściowe stany Ca2 + w hodowanych, stymulowanych (0,5 Hz) miocytach sercowych w obecności i przy braku przedłużonej stymulacji a1AR według ISO. Stymulacja. 1AR znacząco zwiększała zarówno rozkurczowe, jak i skurczowe Ca2 +, z najbardziej znaczącym efektem rozkurczowym w stymulowanych miocytach sercowych (Figura 4b). Tak więc, stymulacja. 1AR zwiększa cytozolowe Ca2 + zarówno w kurczących się, jak i niesprężających miocytach sercowych. W celu ustalenia, czy zmieniona homeostaza Ca2 + jest przyczynowo związana z apoptozą indukowaną przez AARAR, zahamowaliśmy wejście Ca2 + przez nifedypinę lub buforowany wewnątrzkomórkowy Ca2 + przez inkubowanie komórek z EGTA-AM. Obie terapie uratowały miocyty sercowe przed apoptozą indukowaną przez 1AR (figura 4c). Ponadto, zmierzono obciążenie Ca2 + SR, indeksowane przez amplitudę przejściowych Ca2 + generowanych w odpowiedzi na podanie kofeiny w bolusie (20. M) [hasła pokrewne: luxmed lublin odbiór wyników, rezonans magnetyczny przeciwwskazania, proces pielęgnowania pacjenta z nadciśnieniem tętniczym ] [przypisy: nietrzymanie moczu zabieg, szpital lublin jaczewskiego, dieta paleo jadłospis na tydzień ]
