Ekspresję RNA SGCG wykryto w przeprogramowanych przez MyoD fibroblastach zarówno z kontroli jak i pacjenta LGMD 2C (ex6del). Stopień ekspresji RNA SGCG był jakościowo mniejszy w przypadku ex6del, zgodnie z obecnością pojedynczego funkcjonalnego allelu SGCG i / lub rozpadu z udziałem nonsensu. Figura 7A-mediowana korekcja ramki odczytu w ludzkich zmutowanych komórkach SGCG. (A) Pokazano 2 różne allele od osobnika z LGMD 2C wpływającego na locus SGCG, delecję 1,4 MB obejmującą wiele genów (niebieski zacieniony obszar, góra) i mniejszą delecję obejmującą ekson 6 SGCG w całości (niebieski zacieniony obszar, średni schemat). Liczby odnoszą się do pozycji genomu w hg19. Organizacja eksonów dla transkryptów SGCG z delecją egzonu 6 (ex6del) jest pokazana w dolnym schemacie. Gwiazdka oznacza stronę początkową transkrypcji. Czerwona strzałka wskazuje przedwczesny kodon stop. (B) Fibroblasty skóry z kontroli i ex6del uzyskano i przeprogramowano do linii miogennej przy użyciu indukowalnego tamoksyfenem MyoD (31, 32). Ekspresja ekspresji (czerwona) i wielordzeniowa tworzenie miotubiny wskazały miogeniczne przeprogramowanie po wystawieniu na działanie 4OH-tamoksyfenu (5 .M, 48 godzin) i hodowlę w pożywce różnicowania. Nuklei oznaczono Hoechst 3342 (niebieski). Skala słupków: 10. M. (C) RT-PCR wykazała transkrypty SGCG z mutanta kontrolnego i mutanta ex6del w przeprogramowanych (po prawej) fibroblastach po różnicowaniu (5 (4M 4OH-tamoksyfen, 48 godzin, 12-dniowe różnicowanie). (D) przeprogramowane przez MyoD fibroblasty traktowano AON skierowanymi na eksony 4, 5 i 7 (100 nM / AON, łącznie 300 nM). RT-PCR wykazał oczekiwane pominięte produkty, w tym najmniejszy produkt reprezentujący eksony 2, 3 i 8 i usunięty dla eksonów 4, 5 i 7 (czerwona strzałka). Wyniki z 3 niezależnych powtórzeń przedstawiono dla leczenia AON. NTC, kontrola bez szablonu. Czarna strzałka wskazuje na pojedynczy ekson pomijający ekson 7 w transkrypcie SGCG ex6del, który występuje przy braku leczenia AON. AON stosujące chemię 2-O-O-metylofosforotionianową (2-OMe) były ukierunkowane na obszary wewnątrzeksonowe w eksonach SGCG 4, 5 i 7, zgodnie z wcześniej opisanymi zasadami projektowania antysensownego (33). Transfekcja przeprogramowanych komórek ex6del za pomocą pojedynczych AON 2OMePS wykazała zależne od dawki pomijanie poszczególnych eksonów 5 i 7, z mniejszym pojedynczym pomijaniem egzonu 4 (dodatkowa Figura 6). Co ciekawe, istniały dowody na endogenne pomijanie eksonu 7 w przypadku braku AON w eksonie 7 (dodatkowa figura 6). W celu wygenerowania skorygowanego transkryptu ex6del z pominiętymi wieloma fragmentami odczytu i odczytu, przeprogramowane komórki traktowano mieszaniną AON skierowanych na egzony 4, 5 i 7 (100 nM / AON, łącznie 300 nM). Analiza transkryptów zamplifikowanych przez PCR 3 dni po leczeniu wykazała wytwarzanie skróconego wewnętrznie transkryptu z pożądaną korektą ramki odczytu ex6del SGCG (figura 7D), oprócz produktów pośrednich z pominięciem. Produkt z pominięciem 3-egzonów potwierdzono przez sekwencjonowanie (pomocnicza figura 7). Stosowany tu system hodowli komórkowej wykazuje zmniejszone przeżycie z utrzymującym się wysokim poziomem leczenia MyoD i AON, ograniczając w ten sposób zdolność do mierzenia wyników po więcej niż kilku dniach i ograniczając wykrywanie białka Mini-Gamma. Łącznie dane te pokazują potencjał korygowania mutacji przesunięcia ramki SGCG za pomocą strategii pominięcia wielu znaków. Dyskusja Terapia genowa w dystrofii mięśniowej często opierała się na strategiach wirusowych w zastępowaniu genów. W przypadku DMD było to szczególnie problematyczne ze względu na duży rozmiar genu i białka dystrofiny, a także ograniczoną pojemność wektorów wirusowych. W przypadku LGMD 2C, które jest spowodowane mutacjami SGCG i skutkuje utratą znacznie mniejszego białka a-sarkoglikanu, zainicjowano wirusową terapię genową (34). Jednak wirusowa terapia genowa w przypadku każdej choroby mięśni jest kwestionowana przez potrzebę dostarczenia produktu do wszystkich grup mięśni. Ze względu na te przeszkody, pomijanie eksonu wyłania się jako strategia korekcji genetycznej użyteczności klinicznej. Postęp w badaniach klinicznych nad DMD sugeruje, że pominięcie egzonu można zastosować do innych zaburzeń, w tym zaburzeń nerwowo-mięśniowych. Założenie pominięcia eksonu dla DMD wywodzi się z obserwacji u pacjentów z BMD z delecjami w ramce, które zachowały funkcjonalnie ważne aminokwasy i karboksy-końcowe dystrofiny. Połączona przez X recesywna natura DMD, w połączeniu z powtarzalną strukturą domeny pręcików dystrofiny, czyni DMD idealnym celem pomijania eksonu. Chociaż jest to atrakcyjna metoda korekcji genetycznej, pomijanie eksonu w DMD zazwyczaj daje znacznie niższy poziom białka dystrofiny w porównaniu z endogennymi poziomami dystrofiny.
[więcej w: football trening, leclerc szczecin godziny otwarcia, makabi warszawa ]
[patrz też: football trening, program promocji zdrowia, choroba dwubiegunowa przyczyny ]
