Poprzednio wykazano, że P- i P-sarkoglikan tworzą podjednostkę rdzeniową, a następnie dodano do kompleksu .-cyganoglikan. Ekspresja poszczególnych podjednostek sarkoglikanu. . -,. – lub. -arkaroglikan lub Mini-Gamma. powodowały małą akumulację immunoreaktywności na błonie plazmatycznej (Figura 2A i dane nie przedstawione), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami o współzależności dla normalnego wewnątrzkomórkowego przemytu (26). Koekspresja a- i P-sarkoglikanu, razem z a-sarkoglikanem, prowadziły do wzbogacenia błony plazmatycznej a-sarkoglikanu (Figura 2A, górny prawy panel). Podobnie, ekspresja a- i P-sarkoglikanu i Mini-Gamma również powodowała barwienie Mini-Gamma związane z błoną komórkową (Figura 2A, dolny panel z prawej strony). A-Sarkoglikan i Mini-Gamma ulegały translokacji podobnie do błony, gdy każda była eksprymowana w obecności a- i P-sarkoglikanu (Suplementowa Figura 4). IP wyeksponowanych podjednostek sarkoglikanu przy użyciu przeciwciała anty-sarkoglikanowego potwierdziło obecność kompleksów zawierających a-, (3- i a-sarkoglikan (Figura 2B, panele górne). Podobnie, IP z przeciwciałem anty-sarkoglikanowym wykazało interakcję pomiędzy a-sarkoglikanem, a-sarkoglikanem i Mini-Gammą (Figura 2B, dolne panele). IP dla Mini-Gamma wykrył również. – i. -Sarbroglican (Figura 2B, dolne panele). Dane te pokazują, że Mini-Gamma tworzy kompleks z a- i P-sarkoglikanem, jak pełnowymiarowy a-markaroglikan. Figura 2Mini-Gamma współdziała z (3-i–ararkoglikanami. Plazmidy kodujące sarkoglikany ssaków ulegały ekspresji w komórkach HEK293T. (A) Ekspresja zarówno mini-gamma, jak i pełnej (3-sarkoglikanu (GSG) powodowała akumulację cytoplazmatyczną i okołojądrową. Ta obserwacja jest zgodna z poprzednimi doniesieniami, że związek z rdzeniem P / s-sarkoglikanu jest wymagany do kierowania membranowego (26). Strzałki na lewych panelach wskazują na niewielki brak ruchu błony komórkowej. Koekspresja pełnej długości a-markokoglikanu z a- i a-sarkoglikanem (BSG i DSG) powodowała translokację błony komórkowej a-sarkoglikanu (strzałka w górnym prawym panelu). Podobnie, ekspresja Mini-Gamma z a- i P-sarkoglikanem powodowała translokację błony plazmatycznej Mini-Gamma (strzałka w dolnym prawym panelu). Pręty skali: 5 m. (B) Przeprowadzono Co-IP w celu zbadania tworzenia kompleksu sarkoglikanu z eksperymentów ekspresji heterologicznych komórek HEK293T. Po IP z przeciwciałem anty-sarkoglikanowym wykryto w. /. /. Kompleks zawierający a-, a- i a-sarkoglikan. koekspresyjne komórki (górne panele). Podobnie, IP z tym samym przeciwciałem anty-sarkoglikanowym wykazało oddziaływanie między a- i P-sarkoglikanem i Mini-Gamma (dolne panele). Adres IP dla Mini-Gamma wykorzystujący przeciwciało przeciwko znacznikowi Xpress również wykrył P- i P-sarkoglikan. MG, Mini-Gamma. Mini-Gamma włącza się do kompleksu sarkoglikanu in vivo. Aby przetestować funkcję Mini-Gamma in vivo, wygenerowano transgeniczne myszy eksprymujące Mini-Gamma pod kontrolą promotora desminy. Promotor desminy jest aktywny zarówno w mięśniu sercowym, jak i mięśniach szkieletowych (27). Scharakteryzowano dwie linie. Linia Tg50 wykazała ekspresję wyższego poziomu, przy ekspresji Mini-Gamma na poziomie 3-krotności poziomu endogennego białka a-sarkoglikanu. Linia Tg84 miała ekspresję niższego poziomu, z Mini-Gamma wyrażoną na 6%. 9% endogennego białka. -Sarkoglikanu (Figura 3A). Frakcjonowanie mikrosomalne mięśni wykorzystano do monitorowania ekspresji Mini-Gamma w mięśniach poprzez rozdzielenie frakcji surowych całkowitych lizatów mięśniowych na frakcję cytoplazmatyczną, lekkie mikrosomalne i ciężkie frakcje mikrosomalne. Sarcolemma, retikulum endoplazmatyczne i białka błonowe związane z aparatem Golgiego są wzbogacone w ciężką frakcję mikrosomalną. U zwierząt WT białka sarkoglikanu i inne związane z błoną składniki DGC występują głównie w ciężkiej frakcji mikrosomalnej mięśni (28). Podobnie do endogennego a-sarkoglikanu, białko Mini-Gamma było wysoko wzbogacone w ciężkie mikrosomy z obu linii transgenicznych, co wskazuje na jego normalny ruch w mięśniach (Figura 3B, ścieżki HM). Małe ilości mini-gammy wykryto w innych frakcjach błony, prawdopodobnie zgodnej z rywalizacją między Mini-Gamma i pełnej długości białkiem. -Sarkoglikan. Aby udokumentować lokalizację wewnątrzkomórkową, zastosowano mikroskopię immunofluorescencyjną w celu zademonstrowania sarklemalnego wzoru białka Mini-Gamma w mięśniach szkieletowych (ryc. 3C). Co ciekawe, endogenny a-sarkoglikan był nieznacznie zmniejszony u transgenicznych zwierząt Mini-Gamma w porównaniu z identycznie i jednocześnie przetworzonymi skrawkami mięśni zwierząt WT, co sugeruje rywalizację o lokalizację błony komórkowej między Mini-Gamma i endogennym białkiem a-sarkoglikanu (Figura 3C). Figura 3Mini-Gamma włącza się do kompleksu sarkoglikanu in vivo
[patrz też: stargard szczeciński szpital, bakteryjne zapalenie pochwy leki, makabi ]
[podobne: stargard szczeciński szpital, nietrzymanie moczu zabieg, szpital lublin jaczewskiego ]
