Jest to pierwsza demonstracja, że claudin może nadawać selektywność jonową do transportu pozakomórkowego i prowadzi do przewidywania, że kombinacja różnych claudyn definiuje ogólną selektywność różnych połączeń. Metody Konstrukty cDNA plazmidu. Ludzką chromatynę-4 o pełnej długości amplifikowano metodą PCR z użyciem cDNA ludzkiej nerki (Quick-clone cDNA; CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto, California, USA) jako matrycy i startera 56948 (5a-CGGGATCCCTGACAATGGCCTCCATGGGGCTAC-3 .), startera. 56949 (5a-GCTCTAGATTACACGTAGTTGCTGGCAGC-3a) i polimeraza Taq (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA). Zamplifikowany produkt wklonowano do wektora TOPO-TA (Invitrogen Corp., San Diego, California, USA) i subklonowano przy użyciu EcoRI do wektora pTRE (CLONTECH Laboratories Inc.). Sekwencję DNA sprawdzono w obu kierunkach. Hodowla komórek i generowanie stabilnych linii. Ludzką chromatynę-4 transfekowano do komórek tet-off MDCK II (CLONTECH Laboratories Inc.) wraz z 20-krotnie mniejszym plazmidem do selekcji pTKhyg, stosując protokół Lipofectamine (Life Technologies Inc., Grand Island, Nowy Jork, USA). Klony poddane transfekcji Claudin-4 (3 wybrano w 0,2 mg / ml higromycyny B, a odporne klony utrzymywano w DMEM z wysokimi stężeniami glukozy uzupełnionym 10% FBS, penicyliną / streptomycyną, 0,1 mg / ml higromycyny i 50 ng / ml doksycykliny. Linie komórkowe badano przesiewowo metodą immunoblottingu. W celu przeprowadzenia eksperymentów komórki poddano trypsynizacji i przeniesiono na Snapwells (Corning Inc. Life Sciences, Acton, Massachusetts, USA) w ilości 5 x 104 komórek / studzienkę w pożywce zawierającej doksycyklinę (50 ng / ml) lub bez doksycykliny (DMEM o wysokiej zawartości glukozy; suplementowany penicyliną / streptomycyną i 10% FBS, CLONTECH Laboratories Inc., certyfikowana surowica wolna od tetracykliny). Komórki powleczone dla eksperymentów podawano codziennie z odpowiednimi pożywkami. Mikroskopia immunofluorescencyjna. Komórki hodowano na filtrach (Transwell-Clear, Corning Inc. Life Sciences) i wszystkie sposoby immunolokalizacji opisano wcześniej (17). ZO-1 wykryto mysim mAb (1: 300; Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, California, USA); Claudin-4 wykrywano za pomocą króliczego przeciwciała poliklonalnego wobec ludzkiej claudin-4 (1: 100; Zymed Laboratories Inc.). Wtórne przeciwciała Ab były znakowane Cy3 anty-mysimi i znakowanymi Cy-2 . oczyszczonymi powinowactwem przeciwciałami swoistymi wobec gatunku króliczego przeciw króliczym (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA). Całą mikroskopię wykonano mikroskopem Nikon Microphot FX z obiektywem x 60 PlanApo, a obrazy rejestrowano przy użyciu chłodzonej sensorycznie kamery CCD. Obrazy zostały następnie przetworzone przy użyciu oprogramowania OpenLab (Improvision Inc., Lexington, Massachusetts, USA) i Adobe Photoshop 5.0 (Adobe Systems Inc., San Jose, Kalifornia, USA). Mikroskopia elektronowa z mikroskopem z rozbiciem. Analizę metodą liofilizacji nieindukowanych i indukowanych komórek MDCK przeprowadzono jak opisano wcześniej (18). Wykonano badania zestawów replik z dwóch oddzielnych, nieindukowanych i indukowanych klonów komórek MDCK, a wzory zamrożonych pęknięć były podobne dla każdego z nich. Analiza immunoblotowa. W celu określenia profili ekspresji nadekspresjonujących linii komórkowych claudin-4, transfekowane komórki MDCK wysiano na dwanaście studzienkowych szalek na filtrach z tran-studzienkami. Nie obserwowano różnic w kinetyce lub poziomie indukcji białka związanych z podłożem do wysiewu. Ekspresję białka indukowano przez usuwanie doksycykliny przez 4 dni; Poziom białka claudin-4 był zawsze porównywany z poziomem obserwowanym w nieindukowanych komórkach tej samej linii klonalnej. Doksycyklina nie miała widocznego wpływu na liczbę komórek ani na wielkość komórek; na poziom endogennej chromatyny-4 nie wpływało leczenie doksycykliną w linii komórek rodzicielskich (dane nie pokazane). Przygotowanie próbki przeprowadzono w sposób opisany wcześniej (18). Gdy komórki hodowano na filtrach, cały filtr usunięto i umieszczono w 100. 200 ul buforu do próbek. Próbki przechowywano w temperaturze <80 ° C przed analizą. Równe objętości lizatu poddano SDS-PAGE (13% żele poliakryloamidowe dla claudin, 8% żele dla ZO-1 i okludyny) i przeniesiono na nitrocelulozę. Ab (wszystkie z Zymed Laboratories Inc.) zastosowane do analizy immunoblotów to: claudin-1/3 (1: 1000, ta część krzyża ab claudin-1 reaguje z claudin-3 i ewentualnie claudin-20) i claudin-4. poliklonalne (1: 1000) mAb Ab., mysi claudin-2 (1: 2500), mysie przeciwciało przeciw ludzkiemu ZO-1 (1: 1000) i mAb przeciwko ludzkiemu okludinowi (1: 1000). Kompleksy antygen-Ab wykrywano ze sprzężonymi z peroksydazą chrzanową sprzężonymi (sprzężonymi z HRP) wtórnymi Ab przez wzmocnioną chemiluminescencję (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, New Jersey, USA). Pomiary elektrofizjologiczne. Badania przeprowadzono na monowarstwach komórek hodowanych na porowatych filtrach (Snapwell; Corning Inc [przypisy: luxmed lublin odbiór wyników, makabi, dieta paleo jadłospis na tydzień ] [przypisy: tomografia komputerowa cennik, karpacz informacja turystyczna, bakteryjne zapalenie pochwy leki ]
