Wyniki Indukowana ekspresja claudiny-4 nie zmienia poziomów innych białek o zaciśniętych złączach. Claudin-4 jest normalnie wykrywalny w komórkach MDCK (23). W związku z tym najlepiej byłoby wprowadzić oznaczoną epitopowo wersję claudin-4, aby można było odróżnić jej ekspresję i lokalizację komórkową od białka endogennego. Jednak zdecydowaliśmy się nie używać oznaczonych konstrukcji z określonych powodów. Najpierw zaobserwowaliśmy (dane niepokazane), że znakowane białka nie ulegały ekspresji lub pozostawały w przedziale wewnątrzkomórkowym, gdy sekwencja znacznika VSV-G została umieszczona w dowolnej z trzech różnych pozycji w sekwencji. Po drugie, wcześniej opublikowane wyniki wykazały funkcjonalne różnice między karboksyterminalnie znakowanym i nieoznaczonym claudin-1, gdy ulegają ekspresji w komórkach MDCK (13). W związku z tym użyliśmy pozbawionej łańcuchów ludzkiej ludzkiej claudyny-4 typu dzikiego w indukowalnym systemie ekspresji, a wszystkie porównania opierają się na różnicy w obrębie poszczególnych klonów między ich stanami nieindukowanymi a indukowanymi. To również wyeliminowało potencjalny i istotny problem zmienności klonalnej. Komórki MDCK Tet-off transfekowano pTRE- (Claudin-4), a selekcję transfekowanych klonów przeprowadzono przez analizę immunoblot kolonii opornych na higromycynę. Analiza 40 odpornych na higromycynę kolonii dostarczyła 15 klonów wykazujących silną indukcję białka o oczekiwanej wielkości, około 22 kDa. Do dalszych badań wybrano pięć klonów, ponieważ miały niski poziom podstawowy claudin-4 na immunoblotach i były wysoce indukowalne. Figura pokazuje indukcję claudyny-4 po 4 dniach w trzech reprezentatywnych klonach. W każdym z nich występują zmienne poziomy podstawowej ekspresji. Silną indukcję między czterokrotnym a dziesięciokrotnym wzrostem obserwowano we wszystkich klonach po 4 dniach. Nie obserwowano zmiany poziomów claudyny-1/3 i claudiny-2 w połączeniu z indukcją wyższych poziomów claudin-4 (ryc. 1, b i c). Ponadto, indukcja klaudiny-4 nie ma oczywistego wpływu na poziomy innego białka przezbłonowego, okludiny (Figura 1d) lub białka cytoplazmatycznego, które wiąże się z claudinami, ZO-1 (Figura 1e). Wyniki te są podobne do braku wpływu na ZO-1 i okludyny związanej z nadekspresją claudiny-1 w komórkach MDCK (13). Wnioskujemy, że wszelkie zmiany fizjologiczne związane z nadekspresją claudiny-4 mogą być pierwotne, a nie wtórne do zmian poziomu innych białek połączeń. Figura Analiza immunoblot indukcji w trzech osobnych klonach klonów MDCK ufundowanych przez claudin-4 (3, 15, 39 i 43. Komórki hodowano na filtrach przez 4 dni w obecności (+) lub nieobecności (a) 50 ng / ml doksycykliny. Wiele alikwotów z tych samych próbek rozdzielono przez SDS-PAGE, a następnie przeprowadzono analizę immunologiczną dla (a) claudin-4, (b) claudin-1/3, (c) claudin-2, (d) occludin i (e) ZO -1. Blot claudin-4 celowo prześwietlany w celu ujawnienia ekspresji białka w nieindukowanych komórkach tet-off; dolny prążek wynika z proteolizy podczas przygotowywania próbki. Nadekspresja Claudin-4 nie ma widocznego wpływu na inne zmierzone białka o zaciśniętych szczelinach. Obecność lub brak doksycykliny nie ma wpływu na ekspresję claudyny-4 w nietransfekowanych komórkach MDCK. Immunolokalizacja claudin-4 i mikroskopia elektronowa z zamrażaniem pęknięć. Następnie wykorzystaliśmy pośrednią immunofluorescencję do określenia lokalizacji komórkowej nadekspresjonowanej Claudin-4 (ryc. 2). Znaczący wzrost barwienia na granicach komórek był powtarzalny we wszystkich klonach (ryc. 2, b i d). Ta lokalizacja była również obserwowana w nieindukowanych komórkach i została opisana poprzednio przez Sonoda i in. w nietransfekowanych komórkach MDCK (23). W przeciwieństwie do tego, oba białka sprzężone złączy ZO-1 (Figura 2, a i c) i okludyna (nie pokazane) były zatężane na stykach ze złączami wierzchołkowymi. Nie można jednak wykluczyć istnienia drobnych bocznych pul ZO-1 i okludyny za pomocą tych technik, a w rzeczywistości McCarthy et al. (13) wykazali rzadkie włączenie okludyny w boczne fibryle claudin-1. Figura 2 Kolonizacja immunofluorescencji ZO-1 i claudiny-4 w komórkach MDCK transfekowanych tet-off claudin-4 (3. Komórki umieszczono na filtrach i hodowano przez 4 dni w obecności (aib) lub nieobecności (cid) 50 ng / ml doksycykliny i barwiono na ZO-1 (a i c) i claudin-4 (bid). ). ZO-1 jest wąsko skupiony na wierzchołkowym połączeniu, podczas gdy claudin-4 zarówno w nieindukowanych (b), jak i indukowanych (d) komórkach MDCK jest skoncentrowany na granicach komórek-komórek. Wykonaliśmy mikroskopię elektronową typu freeze-fracture , aby określić, czy nadekspresja spowodowała zmiany w nitkach złącza. Oddzielono dwie oddzielne linie klonalne zarówno dla nieindukowanych (21 replik całkowitych) i indukowanych komórek (20 replik całkowitych), jak i wykazując wysoce stałą różnicę
[więcej w: rezonans magnetyczny otwarty warszawa, proces pielęgnowania pacjenta z nadciśnieniem tętniczym, witaminy dla nastolatków ]
[więcej w: luxmed lublin odbiór wyników, leclerc szczecin godziny otwarcia, rezonans magnetyczny przeciwwskazania ]
