MMP i ADAM badano intensywnie i scharakteryzowano wiele niskocząsteczkowych inhibitorów zarówno w hodowli komórkowej, jak i modelach zwierzęcych, głównie w celu zahamowania inwazji komórek nowotworowych zależnej od MMP. Pomimo względnego sukcesu badań przedklinicznych, wyniki wielu badań klinicznych inhibitorów MMP w leczeniu raka rozczarowały, być może z powodu tego, co wydaje się być wadliwym projektem badań III fazy (38). Stało się jasne, że metaloproteinazy odgrywają bardziej złożoną i zróżnicowaną rolę w progresji nowotworu (39) niż doceniono podczas projektowania tych wcześniejszych badań klinicznych. Pozostaje możliwe, że związki te mogą okazać się skuteczne w wybranych podgrupach pacjentów, przy czym jedną z takich kohort są osoby zależne od autokrynnej stymulacji EGFR / ErbB2 zależnej od TACE. Specyficzne i aktywne doustnie inhibitory TACE zostały opracowane przez Roche Diagnostics (40) i Wyeth (41) do leczenia zapalenia stawów (TACE rozszczepia również TNF-a, ważną prozapalną cytokinę w tej chorobie). Nasze dane sugerują, że ich skuteczność powinna być oceniana w przedklinicznym modelu zależnej od ligandu EGFR powstawania nowotworu. Dane z badań fazy I wskazują, że te selektywne leki powodują stosunkowo niewiele skutków ubocznych w porównaniu z inhibitorami MMP pierwszej generacji, dla których toksyczność ograniczająca dawkę okazała się poważnym problemem klinicznym. Dane opisują ponadto mechanizm, za pomocą którego komórki nabłonkowe piersi mogą uciec przed zależnością od zewnętrznych sygnałów proliferacyjnych, przejście niezbędne w ewolucji wszystkich nowotworów. TACE wydaje się odgrywać zasadniczą rolę w tej ucieczce. Hamowanie tej proteazy blokowało przekazywanie sygnału przez EGFR i przywracało fenotyp złośliwy, co sugeruje, że przerwanie takiej pętli autokrynnej, z pojedynczym czynnikiem lub w połączeniu z istniejącymi inhibitorami EGFR, może okazać się skuteczną terapią dla nowotworów zależnych od ekspresji ligandu EGFR. Metody Kultura komórkowa. Wszystkie odczynniki zakupiono od Sigma-Aldrich, o ile nie zaznaczono inaczej. Komórki HMT3522 hodowano na podłożach 2D i 3D w pożywce H14, mieszaninie 50:50 DMEM / F12 (UCSF Cell Culture Facility) uzupełnionej 5 ug / ml prolaktyny, 250 ng / ml insuliny, 1,4 x 10. 6 M hydrokortyzonu. , 10. 10 M. -Estradiol, 2,6 ng / ml selenianu sodu i 10. G / ml transferyny. Komórki S1 dodatkowo suplementowano 10 ng / ml EGF. W różnych eksperymentach komórki były uzupełniane AREG, TACE i TGF-a. We wszystkich przypadkach AREG i TGF-. zastosowano w tym samym stężeniu molowym jak EGF (860 pM). W przypadku hodowli 3D lrECM, komórki T4-2 zaszczepiono w ilości 21 000 komórek na cm2 na wierzchu Matrigel, nałożono pożywkę H14 zawierającą 5% Matrigel (BD Biosciences) i potraktowano 80 nM AG1478, 20. M TAPI-2, 0,3 nM. Iressa lub odpowiednie elementy sterujące pojazdu. Amfipotropowe retrowirusy wytworzono przez transfekcję (Lipofectamine, Invitrogen) linii komórek pakujących Phoenix (dar G. Nolan, Stanford University, Stanford, California, USA) z pBM-IRES-puro lub pochodnymi zawierającymi AREG lub TGF-. otwarte ramki do czytania. Posiewaliśmy 2 x 106 komórek fenotypowych na 6 cm naczynie, a następnego dnia transfekowano je 2 .g odpowiedniej konstrukcji retrowirusowej. Pożywkę hodowlaną zawierającą retrowirusy zebrano po 48 godzinach, uzupełniono polibrenem do 5 ug / ml i dodano do komórek HMT3522 przy 30% -50% konfluencji. Pule stabilnych zakażeń wybrano w .g / ml puromycyny. Tłumione siRNA przeciwko TACE (Ambion) transfekowano zgodnie z protokołem odwrotnej transfekcji Invitrogen. siRNA przeciwko następującym sekwencjom nici sensownej TACE transfekowano indywidualnie (100 nM) lub jako pulę (33,3 nM każda): CCAGAGACUCGAGAAGCUUTT, GCAGCAUUCGGUAAGAAAATT i CGAGAACAAUAAGAUGUUUTT. W przypadku testów hodowli 3D komórki T4-2 trypsynizowano po transfekcji i wysiewano jako pojedyncze komórki w Matrigel. Knockdown oceniano metodą Western blot z równoległej transfekcji 48 godzin po transfekcji. Losową sekwencję siRNA zastosowano jako kontrolę ujemną. Pośrednia immunofluorescencja. Kolonie solubilizowano z hodowli Matrigel przez wytrząsanie w PBS z 0,05 M EDTA na lodzie przez 30 minut, utrwalono w 1: metanolu / acetonie w. 20 ° C, zabarwiono integryną anty. 6 (Chemicon International) i wybarwiono kontrastowo DAPI. . Western blotting. Komórki poddano lizie w 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5% NP-40 uzupełnionym inhibitorami proteazy i fosfatazy (Calbiochem) i sklarowano przez odwirowanie. Frakcjonowaliśmy 50 .g każdej próbki metodą SDS-PAGE, przenieśliśmy je na membrany nitrocelulozowe i sondowano je przeciwciałami przeciwko następującym białkom: fosforylowanej MAPK, całkowitej MAPK, fosforylowanej kinazie p70S6 (Cell Signaling Technology) i TACE (Chemicon International)
[podobne: bakteryjne zapalenie pochwy leki, rezonans magnetyczny przeciwwskazania, rezonans magnetyczny otwarty warszawa ]
[przypisy: dieta paleo jadłospis na tydzień, szczepienie dur brzuszny, witaminy dla nastolatków ]
