E-kadheryna (BD Biosciences) była używana jako kontrola obciążenia. Bloty opracowano przy użyciu odczynnika chemiluminescencyjnego SuperSignal West Femto (Pierce Biotechnology). Obrazy zostały wykonane przy użyciu aparatu FluorChem 8900 (Alpha Innotech). ELISA. Równą liczbę komórek przemyto 3 razy i pozostawiono do kondycjonowania środowiska przez 90 minut. Ilość AREG i TGF-. gromadzenie się w pożywce określano za pomocą specyficznych testów ELISA (R & D Systems) zgodnie z instrukcjami producenta. Klonowanie pełnej długości AREG i TGF- .. Otwarte ramki odczytu tych genów amplifikowano przez PCR z cDNA T4-2. Produkty amplifikacji klonowano, sprawdzano sekwencyjnie i subklonowano do retrowirusowego wektora ekspresyjnego pBM-IRES-puro (42). Zastosowane startery były następujące: AREG, 5a-GACCTCAATGACACCTACTCTGG-3. i 5a-GAAATATTCTTGCTGACATTTGC-3; TGF-a, 5a-ATGGTCCCCTCGGCTGGACAGCTC-3. i 5. -TCATAGATCTTCTTCTGATATAAGCTTTTGTTCGACCACTGTTTCTGAGTGGC-3 .. Mutanty AREG i TGF-. wytworzono stosując starter specyficzny dla pBM-IRES-puro . 5a-TGGAAAGGACCTTACACAGTCC-3. i albo 5. -AAAAGGATCCTCATTTTGATAAACTACTGTCAATC-3. (AREG. TM) lub 5. -AAAAGGATCCTCAGGCCTGCTTCTTCTGGCTGGC-3. (TGF-a .) i klonowano do pBM-IRES-puro. Testy proliferacji. Komórki HMT3522 wysiewano na 48-studzienkowych płytkach i traktowano (w trzech powtórzeniach), jak opisano w legendach figur. W celu określenia względnego wzrostu do podłoża dodano 0,1 objętości odczynnika do analizy proliferacji komórek WST (Roche Diagnostics), a jego metabolit formazanu mierzono absorbancją przy 460 nm. Ilościowe określenie wielkości kolonii w kulturze 3D lrECM przeprowadzono za pomocą analizy obrazu. Reprezentatywne obrazy zostały wykonane przy użyciu aparatu cyfrowego (Nikon Coolpix 4500) podłączonego do mikroskopu z kontrastem fazowym (Nikon Eclipse TS100). Obrazy cyfrowe o wysokiej rozdzielczości zostały następnie przeanalizowane przy użyciu oprogramowania NIH ImageJ (wersja 1.36b, http://rsb.info.nih.gov/nih-image/), a pole przekroju każdej kolonii określono dla wielu kolonii . Proces ten był ręcznie kontrolowany, aby zapewnić, że agregaty kolonii nie były mierzone jako pojedyncza kolonia. RT-PCR. Całkowite RNA traktowane DNazą izolowano przy użyciu zestawu RNeasy Mini (Qiagen). Użyto 5 .g całkowitego RNA w końcowej objętości wynoszącej 40 .l dla syntezy cDNA z primacją oligo-dT (zestaw cDNA syntezy First Strand, Invitrogen). Zastosowano następujące startery: AREG, 5a-GACCTCAATGACACCTACTCTGG-3. i 5a-GAAATATTCTTGCTGACATTTGC-3; GAPDH, 5. -CCCCTGGCCAAGGTCATCCATGAC-3. i 5A-CATACCAGGAAATGAGCTTGACAAAG-3; TACE, 5. -CAGCACAGCTGCCAAGTCATT-3. i 5a-CCAGCATCTGCTAAGTCACTTCC-3 .; TGF-a, 5-CACACTCAGTTCTGCTTCCA-3. i 5. -TCAGACCACTGTTTCTGAGTGGC-3 .. Statystyka. Wszystkie analizy danych przeprowadzono przy użyciu programu GraphPad Prism w wersji 4.03. Wykresy słupkowe oznaczają średnie. SEM. Istotność określono przy użyciu ANOVA. Na wykresach rozproszenia poziomy pasek reprezentuje medianę każdego zestawu danych. Istotność określono za pomocą testu Kruskala-Wallisa (z testem Dunna dla korekty wielokrotnych porównań). Baza danych ekspresji genów składająca się z profili mikromacierzy 295 ludzkich nowotworów sutka z powiązanymi danymi klinicznymi (15) została uzyskana od Rosetta Inpharmatics. Współczynnik korelacji Pearsona zastosowano do określenia, czy istnieją statystycznie istotne asocjacje pomiędzy względnymi poziomami ekspresji każdego ze znaczników. W analizie przeżycia pacjentów podzielono na kwartyle w celu ekspresji każdego markera, a krzywe przeżycia obliczono za pomocą metody Kaplana i Meiera. Istotność statystyczną określono przy użyciu testu log-rank. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za statystycznie istotną. Materiały uzupełniające Zobacz Dodatkowe dane Podziękowania Podziękowania dla Derek Radisky za krytyczne przeczytanie manuskryptu i pomocnych sugestii; Jimmie Fata, Mark Sternlicht i Mathew Coleman za stymulowanie dyskusji; oraz Dinah Levy i Christiane Abouzeid za doskonałą pomoc techniczną. Z wdzięcznością dziękujemy Dimitry Nuyten z Holenderskiego Instytutu Raka za udostępnienie najnowszych danych uzupełniających z zestawu danych 295 pacjentów przed publikacją. Badania te były wspierane przez granty i nagrodę Distinguished Fellowship od Departamentu Energii USA, Biura Badań Biologicznych i Środowiskowych (DE-AC03 SF0098), przez National Cancer Institute (2 R01 CA064786-09) oraz nagrodę Innovator Award od Departament Obrony Breast Cancer Research Programme (BC012005) do MJ Bissell. PA Kenny był wspierany przez stypendia z Fundacji Susan G. Komen Breast Cancer Foundation (2000-223) i Departamentu Obrony Breast Cancer Research Program (DAMD17-00-1-0224). Przypisy Niestandardowe skróty: ADAM, dezintegracja i metaloproteinaza; AREG, amfiregulina; ERa, receptor estrogenu; lrECM, bogata w lamininę matryca pozakomórkowa; TACE, TNF-a, enzym konwertujący; TAPI-2, inhibitor proteazy TNFa2. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Refe Clin. Invest.117: 337. 345 (2007). doi: 10,1172 / JCI29518
[więcej w: tomografia komputerowa cennik, szpital lublin jaczewskiego, luxmed lublin odbiór wyników ]
[patrz też: makabi, makabi warszawa, etnoliga ]
