Jak pokazano wcześniej w innych liniach komórkowych raka okrężnicy, konstytucyjna ekspresja mRNA COX-2 była obserwowana w obu typach komórek. Jednak poziom mRNA COX-2 w komórkach HT29 był mniejszy niż 20% mRNA znalezionego w komórkach LoVo. Jako kontrolę zbadano poziom m-RNA protoonkogenu c-myc i stwierdzono, że jest on zasadniczo taki sam w dwóch typach komórek. Konstrukt reporterowy zawierający fragment 1,8 kb ludzkiego promotora COX-2 zastosowano do wykazania, że wysoki poziom mRNA COX-2 obserwowany w komórkach LoVo wynika ze zwiększonej transkrypcji (Figura 2b). Nie zaobserwowano różnic w ekspresji kontrolnych konstruktów reporterowych bez promotora lub zawierających promotor SV40 (dane nie pokazane). Odkrycia te sugerują, że w komórkach HT29 występuje zmieniona transkrypcja potranskrypcyjna, co sprzyja zwiększonej syntezie enzymu COX-2 z niskich poziomów mRNA. Figura 2 Transkryptowana kontrola mRNA COX-2. (a) Stałe poziomy mRNA COX-2 i c-myc w komórkach HT29 i LoVo wykrywano za pomocą testów ochrony RNazą. Chroniony mRNA dla c-myc wykryto jako dublet. MRNA GAPDH przedstawiono jako kontrolę dla obciążenia RNA. Przedstawione dane reprezentują trzy eksperymenty. (b) Poziomy konstytutywnej transkrypcji COX-2 w komórkach HT29 i LoVo. Konstrukt reporterowy lucyferazy zawierający promotor COX-2 (wypełnione słupki) lub wektor pGL3 (puste słupki) kotransfekowano wektorem kontrolnym pSV-P-galaktozydazy. Aktywność promotora oceniano jako aktywność lucyferazy znormalizowaną względem aktywności p-galaktozydazy i jest średnią z trzech eksperymentów. (c) Eksperymenty półtrwania mRNA zapoczątkowano przez dodanie 5 ug / ml ActD do HT29 i komórek LoVo we wskazanych czasach i zanotowano mRNA dla COX-2 przez analizę Northern biot dla COX-2 i kontroli wewnętrznej GAPDH. Czasy ekspozycji na blot skorygowano, aby uzyskać podobne początkowe natężenia mRNA COX-2. Zanik mRNA c-myc analizowano podobnie za pomocą testu ochrony przed RNazą z użyciem rybosonek dla c-myc i kontroli wewnętrznej GAPDH. Przedstawione dane reprezentują zduplikowane eksperymenty. Prawidłowy wzrost komórkowy jest związany z szybkim rozpadem mRNA COX-2, podczas gdy stabilizacja mRNA COX-2 jest obserwowana w warunkach sprzyjających wzrostowi nowotworu (19, 20). Aby określić, czy komórki HT29 są uszkodzone w tym aspekcie potranskrypcyjnej kontroli, badano rozkład endogennego mRNA COX-2. Okres półtrwania mRNA COX-2 oceniano metodą Northern blot po dodaniu aktynomycyny D (ActD) do komórek w celu zatrzymania transkrypcji. Wyniki przedstawione na Figurze 2c pokazują, że szybki zanik mRNA COX-2 obserwuje się w komórkach LoVo (t1 / 2 = 44 minuty), jak wcześniej obserwowano w przypadku genów reporterowych zawierających pełnej długości COX-3 3 (3TR lub zakonserwowane bogate w AU. region (19). Przeciwnie, mRNA COX-2 stabilizowano około pięciokrotnie w komórkach HT29 (t1 / 2 = 210 minut). Dla porównania okres półtrwania mRNA konstytutywnie eksprymowanego c-myc oznaczono za pomocą testu ochrony przed RNazą. Szybki obrót mRNA c-myc obserwowano zarówno w komórkach LoVo, jak i HT29 (t1 / 2 = odpowiednio 48 i 42 minuty), co sugeruje, że defekt szybkiego rozpadu mRNA obserwowany w komórkach HT29 występuje w przypadku niektórych, ale nie wszystkich mRNA. Aby zweryfikować, że obserwowana stabilizacja mRNA COX-2 nie jest wynikiem mutacji genowych, sklonowaliśmy i zsekwencjonowaliśmy egzony zawierające region kodujący COX-2 i 3. UTR z obu komórek i stwierdziliśmy, że nie było różnic. W oparciu o zdolność nadekspresji COX-2 do stymulowania wytwarzania angiogenicznych czynników wzrostu (9, 18), przebadaliśmy komórki HT29 i LoVo pod kątem ekspresji VEGF i IL-8. Jak pokazano na Figurze 3a, komórki HT29 wykazują odpowiednio około dziesięciokrotne i dwukrotne wyższe poziomy VEGF (P = 0,0001) i IL-8 (P = 0,0143), niż komórki LoVo. W celu określenia, czy zmiany w szybkim rozpadzie mRNA uwzględnione w zwiększonych poziomach VEGF i IL-8 obserwowanych w komórkach HT29, okresy półtrwania mRNA VEGF i IL-8 badano za pomocą analizy RT-PCR (Figura 3b). Podobnie do wyników pokazanych na Figurze 2c z COX-2, zanotowano szybki zanik mRNA VEGF i IL-8 w komórkach LoVo (t1 / 2 = odpowiednio 51 i 70 minut), podczas gdy stabilizacja obu została wykryta w komórkach HT29 (t1 / 2> 360 minut). Figura 3 Kontrola transkrypcji ekspresji VEGF i IL-8. (a) Ekspresję czynników angiogennych VEGF (lewy panel) i IL-8 (prawy panel) w pożywce hodowlanej HT29 (otwarte słupki) i komórki LoVo (wypełnione słupki) mierzono za pomocą ELISA i są one średnią z trzech eksperymentów. (b) Krzywe prążków mRNA VEGF (trójkąty, kreskowane kreski) i IL-8 (okrężne, ciągłe) mRNA z HT29 (symbole otwarte) i komórki LoVo (wypełnione symbole) uzyskano za pomocą analizy RT-PCR i znormalizowano do kontroli wewnętrznej. GAPDH
[przypisy: rezonans magnetyczny otwarty warszawa, choroba dwubiegunowa przyczyny, bakteryjne zapalenie pochwy leki ]
[podobne: dieta paleo jadłospis na tydzień, szczepienie dur brzuszny, witaminy dla nastolatków ]
